基于免标记DNA构建检测羟基自由基、三磷酸腺苷和银离子的电化学生物传感器

【摘要】电化学生物传感器是利用某些生物活性物质具有选择性识别待测化学物质的能力构建的传感器。近年来,许多免标记的传感器得到了广泛的关注和研究,DNA电化学生物传感器就是其中一种。已有报道的DNA电化学生物传感器在疾病诊断、基因测序、食品安全、环境保护、法医鉴定和金属离子检测等领域,均具有良好的灵敏度和选择性。本文采用方波伏安法、循环伏安法和电化学阻抗技术,构建了三种电化学生物传感器,用以检测羟基自由基、三磷酸腺苷和银离子。1.利用Fenton反应诱导氧化损伤DNA免标记检测羟基自由基利用[Ru(NH3)6]3+做指示探针,采用方波伏安法为检测方法,建立了一种高灵敏、免标记的电化学生物传感器。该传感器是由5’端标记巯基的单链DNA构成,采用巯基己醇封闭电极表面的非特异性结合位点。利用交流阻抗法研究了电极制备和目标物检测的变化过程。由于DNA磷酸骨架带有负电荷,对于带正电荷的[Ru(NH3)6]3+有较强的吸附作用,所以本实验采用[Ru(NH3)6]3+作为电化学信号。Fenton反应产生的羟基自由基能够诱导DNA氧化损伤,甚至断裂,使得DNA脱离电极表面。电极表面DNA减少,吸附的[Ru(NH3)6]3+减少,电化学信号变小。利用此方法,可以检测Fenton反应产生的羟基自由基。结果表明,电流减少量与羟基自由基浓度呈良好的线性关系(R2=0.9956)该传感器具有较宽的线性范围(0.125nM-0.625nM)和较高的灵敏度(80pM)。2.利用切刻剪切酶构建灵敏检测三磷酸腺苷的免标记生物传感器通过Au-S键将三磷酸腺苷适配体组装于金电极表面,适配体对目标物质具有特异性识别,当有目标存在时,DNA构型发生变化,切刻剪切酶能够对形成的双链DNA进行识别剪切,剪切后DNA双链分为两部分,较短部分留在电极表面,因此电极表面电子转移速率增大,电流值大,阻抗减小。实验利用电化学阻抗图谱(EIS)、差分脉冲伏安法(DPV)考察了DNA组装时间和目标作用时间对该传感器的影响。电化学测试在5mM[Fe(CN)6]3-14溶液中进行。在1nM-10μM范围内,电流与三磷酸腺苷浓度的对数呈现良好的线性关系,检测限为156pM。3.基于利用切刻内切酶进行目标循环的电化学方法识别银离子利用Ag-能与C-C碱基对进行选择性结合,构建检测Ag+电化学传感器。以5’端标记巯基的发卡型DNA为捕获探针,通过金硫键作用固定在金电极表面构成了电化学传感器。由于Ag+能与C-C错配碱基对特异性结合形成C-Ag+-C碱基对,加入Ag+和另外一条与发卡探针下部分不完全互补DNA链,可以形成稳定的含有切刻剪切酶识别位点的双链结构,剪切酶进行剪切之后,阻抗减小。实验表明,在0.1nM-1.0μM范围内,阻抗的减少量与Ag+浓度的对数呈现良好的线性关系。该方法具有简单、灵敏、选择性好的优点。
【作者】司劲草；
【导师】李念兵；
【作者基本信息】西南大学，物理化学，2014，硕士
【关键词】电化学生物传感器；羟基自由基；三磷酸腺苷；银离子；免标记；

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